La cattedrale dei Santi Florido e Amanzio è il principale luogo di culto di Città di Castello, chiesa madre della diocesi omonima. Nel dicembre del 1888 papa Leone XIII l'ha elevata alla dignità di basilica minore.
La chiesa, frutto di lavori eseguiti nel corso dei secoli, risulta essere un miscuglio di stili diversi. All'esterno la facciata del Seicento si presenta incompiuta, mentre il lato nord è impreziosito da un ricco portale gotico con bassorilievi (datato prima metà del XIV secolo), preceduto da una scala settecentesca opera di Venanzio Righi. Affianca la chiesa un campanile romanico rotondo, di stile ravennate (XIII secolo).
L'interno dell'edificio, di impronta rinascimentale, è a pianta a croce latina ad un'unica navata con soffitto a cassettoni del Seicento e cappelle laterali. Tra queste si distinguono: la cappella del Santissimo Sacramento di fine Seicento di Nicola Barbioni; la cappella di San Paolo che ospita l'affresco raffigurante la Conversione sulla via di Damasco del Pomarancio. Nel coro sono affrescati episodi della vita di san Florido, mentre gli stalli lignei risalgono alla fine del XVI secolo e sono opera di Raffaellino del Colle. L'altare maggiore è della fine del Settecento, ricostruzione di quello precedente distrutto dal terremoto che fece rovinare la cupola sopra l'altare.
Una scala conduce alla cripta, chiamata anche chiesa inferiore (del XV secolo), ove sono custodite le reliquie dei santi titolari della cattedrale. La cripta conserva il cranio di San Crescentino e anche la statua della Madonna nera di Città di Castello: particolarità di questa Madonna è che, invece di avere fra le braccia il bambin Gesù, tiene nella mano sinistra un'altra donna più piccola, che regge in mano una sfera; inoltre la Madonna porta in testa una corona assomigliante ad una tiara (tipica dei papi).
La chiesa ospita altre opere notevoli di Rosso Fiorentino e Tommaso Conca. L'annesso museo del Duomo raccoglie importanti oggetti liturgici paleocristiani del V e VI secolo, altri arredi sacri medievali ed una Madonna del Pinturicchio.
La Cattedrale ospita sulla cantoria del braccio destro l'organo a corpo unico del 1842 costruito dai fratelli Antonio e Francesco Martinelli. Trasmissione interamente meccanica con tastiera a finestra di 54 tasti (Do1-La2) con prima ottava cromatica. Pedaliera in "sesta" a leggio, di 18 pedali (Do1-La2) costantemente unita al manuale, il diciottesimo (La2) aziona il Tamburo Acustico. Registri azionati da tiranti con pomelli in legno, disposti su due file a destra della tastiera. Tiratutti azionato tramite doppio meccanismo a manovella posta sopra la tavola dei registri oppure da due pedaletti a destra della pedaliera. Grancassa e Piatti azionati tramite pedale in ferro a destra della pedaliera. Restarauto nel 2015 dalla ditta Pinchi di Foligno.